اولتراسانتریفیوژ چیست؟

اولتراسانتریفیوژ یا سانتریفیوژ دور بالا

اولترا سانتریفیوژ (Ultra Centrifuge) یک سانتریفیوژ پیچیده و پیشرفته است که با سرعت بسیار بالایی عمل می کند و مولکول های کوچکتری را که نمی توان از سانتریفیوژهای سنتی جدا کرد، جدا می کند.

سرعت روتورها در اولتراسانتریفیوژ می تواند از 60000 دور در دقیقه تا 150000 دور در دقیقه باشد.
اولتراسانتریفیوژها عمدتاً در آزمایشگاه های تسهیل شده تر برای انجام عملیات پیشرفته تر کار می کنند.
آنها از نظر اندازه بزرگتر هستند و می توانند نمونه ها را به صورت دسته ای یا به عنوان یک سیستم جریان پیوسته کار کنند.
اکثر اولتراسانتریفیوژها به منظور کنترل گرمایی که ممکن است به دلیل سرعت بیش از حد تولید شود، در یخچال نگهداری می‌شوند.

اصل اولتراسانتریفیوژ

اولتراسانتریفیوژ مانند سایر سانتریفیوژهای آزمایشگاهی دیگر کار می کند. کار یک اولتراسانتریفیوژ بر اساس اصل ته نشینی است که بیان می کند که ذرات متراکم تر در مقایسه با ذرات تراکم کمتر تحت گرانش، سریعتر ته نشین می شوند. با این حال، ته نشین شدن ذرات تحت گرانش زمان بیشتری می برد و به همین دلیل است که نیروی اضافی برای کمک به فرآیند ته نشینی اعمال می شود.

در اولتراسانتریفیوژ، نمونه حول یک محور می چرخد ​​و در نتیجه نیروی عمودی به نام نیروی گریز از مرکز ایجاد می شود که بر ذرات مختلف روی نمونه اثر می گذارد. مولکولهای بزرگتر سریعتر حرکت می کنند، در حالی که مولکولهای کوچکتر کندتر حرکت می کنند. در همان زمان، مولکول‌های متراکم‌تر به سمت بیرون به سمت حاشیه لوله‌ها حرکت می‌کنند، در حالی که مولکول‌های چگالی کمتر به سمت مرکز لوله می‌چرخند.

پس از تکمیل فرآیند، ذرات بزرگتر و متراکم تر ته نشین می شوند و گلوله هایی را در پایین لوله تشکیل می دهند. در مقایسه، ذرات کوچکتر و کم چگالتر ، بصورت معلق روی سطح شناور می شوند.

انواع اولتراسانتریفیوژ

بر اساس کاربرد و هدف، اولتراسانتریفیوژ دو نوع است: اولتراسانتریفیوژ تحلیلی ، اولتراسانتریفیوژ آماده سازی

اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (AUC)

همانطور که از نام آن پیداست سانتریفیوژهای تحلیلی، اولتراسانتریفیوژهایی هستند که برای تجزیه و تحلیل ذرات مختلف موجود در نمونه استفاده می شوند.

اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (AUC) یک روش همه کاره و قوی برای تجزیه و تحلیل کمیت ماکرومولکول ها در محلول است. این اولتراسانتریفیوژها دارای سیستم‌های تشخیص برای نظارت بر چرخش و موقعیت ذرات در زمان واقعی برای تعیین ضریب رسوب هستند که به تجزیه و تحلیل ذرات بر اساس شکل، اندازه و جرم کمک می‌کند.

اولتراسانتریفیوژ تحلیلی برای تعیین جرم مولکولی نسبی یک ماکرومولکول را می توان با رویکرد سرعت ته نشینی یا روش تعادل ته نشینی انجام داد.

خواص هیدرودینامیکی ماکرومولکول ها با ضرایب ته نشینی آنها توصیف می شود. ضرایب را می توان از روی سرعت حرکت مرز غلظتی از مولکول های زیستی خاص در میدان گرانشی تعیین کرد.

ضریب رسوب را می توان برای مشخص کردن تغییرات در اندازه و شکل ماکرومولکول ها با تغییر شرایط تجربی استفاده کرد.

سه سیستم نوری برای اولتراسانتریفیوژ تحلیلی (جذب، تداخل و فلورسانس) موجود است که امکان مشاهده دقیق و انتخابی رسوب‌گذاری را در زمان واقعی فراهم می‌کند. یکی از نمونه‌ سیستم‌های تشخیص مورد استفاده در اولتراسانتریفیوژ، سیستم نوری Schlieren است که ذرات موجود در سانتریفیوژ را در زمان واقعی مشاهده می‌کند تا موقعیت و حرکت آنها را تعیین کند.

بر اساس موقعیت، ضرایب رسوب را می توان تعیین کرد که امکان تعیین خواص مولکول های مختلف را فراهم می کند. اولتراسانتریفیوژ تحلیلی بیشتر برای تعیین ویژگی‌های مولکول‌های زیستی مانند پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود.

اولتراسانتریفیوژ آماده سازی

اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی سانتریفیوژهایی هستند که عمدتاً برای جداسازی ذرات در نمونه با فرآیند سانتریفیوژ استفاده می شوند.

در عملکرد اولتراسانتریفیوژ آماده سازی ، محتویات لوله‌ها پس از دوره سانتریفیوژ تجزیه و تحلیل می‌شود، برخلاف سانتریفیوژ تحلیلی که در آن تجزیه و تحلیل در طول فرآیند سانتریفیوژ انجام می‌شود.

اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی را می توان برای انواع مختلفی از فرآیندهای سانتریفیوژ مانند سانتریفیوژ با گرادیان چگالی، سانتریفیوژ دیفرانسیل و سانتریفیوژ ایزوپیکنیک استفاده کرد.

ذرات در یک نمونه بر اساس چگالی یا اندازه آنها از هم جدا می شوند.

در سانتریفیوژ با گرادیان چگالی و سانتریفیوژ ایزوپیکنیک، ذرات نمونه بر اساس چگالی آنها جدا می شوند. ذرات مختلف موجود در یک نمونه به شکل نوارهایی در سطوح مجزا جدا می شوند که چگالی ذره با چگالی محیط برابر است.

اما در سانتریفیوژ دیفرانسیل، ذرات با اعمال سرعت های مختلف روتورها جدا می شوند. ذرات بزرگتر در سرعت های پایین تر ته نشین می شوند، در حالی که ذرات کوچکتر به سرعت بالاتری برای جداسازی نیاز دارند.

از آنجایی که ذرات بر اساس چگالی و اندازه جدا می شوند، می توان از اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی برای تعیین چگالی و اندازه ذرات مختلف استفاده کرد.

ابزار دقیق/ قطعات اولتراسانتریفیوژ

اولتراسانتریفیوژها با قطعات و اجزای مختلفی ارائه می شوند که عملکردهای مختلفی را انجام می دهند.

• روتورها جزء ضروری هر اولتراسانتریفیوژ هستند. اولتراسانتریفیوژها از هر سه نوع روتور، یعنی روتورهای عمودی، روتورهای سطلی نوسانی و روتورهای با زاویه ثابت استفاده می کنند.
• روتور سطلی نوسانی رایج ترین روتور مورد استفاده در اولتراسانتریفیوژ است زیرا بالاترین غلظت ذرات را ایجاد می کند. این به این دلیل است که جهت نیروی گریز از مرکز در روتورهای عمودی با موقعیت لوله ها همسو می شود.
• درایو واحد قدرتی است که سلول‌ها یا لوله‌های نگهدارنده روتور را می‌چرخاند که حاوی محلول مولکول‌ها یا سوسپانسیون ذرات است.
  علاوه بر درایو الکتریکی قابل تعویض و روتورها، شامل روتورهای تحلیلی با حداکثر چهار سلول، دستگاه های دما با برد و کنترل از 0 تا 40 درجه، سلول هایی با ضخامت هایی که ضریب حساسیت 10 را پوشش می دهند و پنجره های کوارتز گوه ای که اجازه چندین سلول را می دهد. به طور همزمان استفاده شود.
• سیستم دما امکان کنترل دما را در سیستم فراهم می کند زیرا تولید گرما در طول عملیات اولتراسانتریفیوژ در سرعت های بالا رایج است.
• اولتراسانتریفیوژ تحلیلی همچنین دارای یک مقایسه کننده دو بعدی با ماشین حساب میز چاپ، تداخل و سیستم های نوری جذب است. سیستم های نوری برای تجزیه و تحلیل بلادرنگ مولکول ها ضروری هستند.
• علاوه بر این، یک دستگاه ایجاد گرادیان، رفرکتومترهای دستی، و یک اسپکتروفتومتر ضبط کننده با سلول جریان و کلکتور کسری نیز ممکن است در یک اولتراسانتریفیوژ آماده سازی وجود داشته باشد.

روش کار با اولتراسانتریفیوژ

فرآیند کار یک اولتراسانتریفیوژ ممکن است بسته به اینکه یک اولتراسانتریفیوژ تحلیلی باشد یا یک اولتراسانتریفیوژ آماده سازی متفاوت باشد. به طور کلی، مراحل زیر در هنگام انجام اولتراسانتریفیوژ تحلیلی انجام می شود:

• اندازه های کوچک نمونه (20-120 میلی متر مکعب) در سلول های تحلیلی گرفته می شود تا در داخل اولتراسانتریفیوژ قرار گیرند.
• سپس اولتراسانتریفیوژ به گونه‌ای عمل می‌شود که نیروی گریز از مرکز باعث مهاجرت مولکول‌های زیستی توزیع شده تصادفی از طریق حلال به صورت شعاعی به سمت خارج از مرکز چرخش می‌شود.
• فاصله مولکول ها از مرکز از طریق سیستم نوری Schlieren تعیین می شود.
• نموداری از غلظت املاح در مقابل مجذور فاصله شعاعی از مرکز چرخش رسم می شود که بر اساس آن جرم مولکولی تعیین می شود.

روش زیر برای عملکرد اولتراسانتریفیوژ آماده سازی است:

1. سانتریفیوژ گرادیان چگالی

• در اولتراسانتریفیوژ آماده سازی با استفاده از گرادیان چگالی، باید یک گرادیان چگالی تهیه شود. برای این کار، یک لایه ساکارز با غلظت کمتر روی یک لایه ساکارز غلیظ تر اعمال می شود که یک گرادیان چگالی ساکارز ایجاد می کند. برخی از اولتراسانتریفیوژها دارای دستگاه‌های شیب‌ساز هستند که می‌توانند به تنهایی گرادیان را بسازند.
• سپس نمونه در لوله سانتریفیوژ بر روی گرادیان قرار می گیرد و سپس لوله ها در قفسه های روتورهای اولتراسانتریفیوژ قرار می گیرند.
• قبل از شروع فرآیند، دما و زمان در اولتراسانتریفیوژ تنظیم می شود.
• درب بسته می شود و فرآیند شروع می شود.
• ذرات از طریق گرادیان حرکت می کنند تا زمانی که به نقطه ای برسند که در آن چگالی آنها با چگالی محیط اطراف مطابقت داشته باشد.
• کسری ها جدا شده و جدا می شوند و ذرات به عنوان واحدهای جدا شده به دست می آیند.

2. سانتریفیوژ دیفرانسیل

• در سانتریفیوژ افتراقی، نمونه در محیط حاوی بافر همگن می شود.
• سپس نمونه در لوله سانتریفیوژ قرار می گیرد که در یک نیروی گریز از مرکز خاص برای مدت زمان مشخصی در یک دمای خاص عمل می کند.
• در پایان این عمل یک گلوله در پایین لوله تشکیل می شود که از مایع رویی جدا می شود.
• مایع رویی به یک لوله سانتریفیوژ جدید اضافه می شود و در آنجا با سرعت دیگری برای زمان و دمای خاص سانتریفیوژ می شود.
• مجدداً مایع رویی از گلوله های تشکیل شده جدا می شود.
• این مراحل تا زمانی ادامه می یابد که همه ذرات از یکدیگر جدا شوند.
• سپس ذرات را می توان با آزمایش شاخص هایی که مختص ذرات خاص هستند شناسایی کرد.

موارد استفاده از اولتراسانتریفیوژ

• اولتراسانتریفیوژهای آماده سازی در زیست شناسی برای کسر گلوله شونده از اندامک های سلولی مانند میتوکندری، ریبوزوم ها و حتی ویروس ها استفاده می شود.
• سانتریفیوژ گرادیان چگالی از گرادیان نمک سزیم برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک مانند DNA و RNA استفاده می کند.
• اولتراسانتریفیوژ تحلیلی امکان تشخیص و شناسایی تغییرات ساختاری ماکرومولکولی را به دلیل تغییر در pH، دما و سایر عوامل محیطی فراهم می کند.
• AUC همچنین امکان تعیین استوکیومتری ماکرومولکول های مختلف مانند جرم مولکولی، اندازه و غیره را فراهم می کند.
• اولتراسانتریفیوژهای تحلیلی همچنین به تمایز بین مونتاژ و جداسازی مجتمع‌های بیومولکولی مختلف کمک می‌کنند.
• اولتراسانتریفیوژها همچنین در تعیین چگالی ماکرومولکول های مختلف استفاده می شوند.
• علاوه بر این، امکان تصفیه عصاره های مختلف بیولوژیکی خام را نیز فراهم می کند.